Штаммы бактерий

rx online

Организмы, E. coli (ATCC 11775), P. aeruginosa (ATCC 9027), E. faecalis (ATCC 19433) и S. aureus (NCTC 6571), размножались в бульоне с максимальным восстановительным разбавителем (MRD) при 22°C (±1°C). Там, где это было возможно, все штаммы были известными болезнетворными патогенами человека с уровнем биобезопасности два, что означало потенциальное легкое заболевание, вызывающее эффект, но трудно заключить контракт с помощью аэрозоли, тем самым сводя к минимуму риск для оператора (Emmert, 2013). В отношении штамма E. coli патогенный штамм не был получен. В результате этого вместо него был выбран штамм типа ATCC 11775.

Организмы поставлялись в виде дисков Vitroid® от компании Sigma-Aldrich Corporation (Гиллингем, Великобритания). Vitroids® — сертифицированный эталонный материал в виде водорастворимой матрицы, инокулированной определенным количеством жизнеспособных микроорганизмов. После того, как диски были полностью растворены в MRD, их перемешивали при 1500 оборотах в минуту с помощью вихревого смесителя в течение приблизительно 15 С для предотвращения бактериальной адгезии к поверхностям труб. Из 100 колониеобразующих единиц (кое) Vitroids® были приготовлены четыре стандартных раствора, каждый из которых содержал отдельный изолированный вид. Это было выполнено путем декантирования обогащенного MRD в 1 л стерильной деионизированной воды. Изоляты интенсивно гомогенизировали перед любой инокуляцией, обеспечивая равномерное распределение организмов по всему сосуду.
Мембранная фильтрация

Обязательным условием использования дисков Vitroid® является обязательный объем инокулята более 10 мл. Было установлено, что использование объемов ниже этого порогового значения приводит к противоречивым и ненадежным результатам. Прямое пипетирование этого количества на агаровую пластину приведет к насыщению абсорбции жидкости в агар, и использование объема, допускаемого для абсорбции в агар, не будет достаточным для выполнения вышеупомянутого объемного требования. Был принят метод мембранной фильтрации, поскольку он позволял использовать большой инокулят путем фиксации организмов на фильтре, который затем помещался на агар для инкубации.

Обогащенный изолят (10 мл) фильтровали через нитроцеллюлозную мембрану с диаметром пор 0,45 Нм при давлении 60 кПа. Было обеспечено, чтобы только один клапан открывался одновременно для поддержания постоянного давления и закрывался сразу же после того, как вода была полностью отфильтрована.

Мембраны асептически удаляли из фильтрующих оснований и наносили на агаровые пластины MacConkey, используя метод нежной прокатки. Было опробовано несколько различных сред, способных культивировать все целевые организмы при идентичных параметрах инкубации, и агар MacConkey был наиболее селективной испытанной средой, которая демонстрировала полный профиль стерилизации в пределах 95% доверительных интервалов к контролю неселективного питательного агара. В начале и в конце каждого периода фильтрации в качестве отрицательного контроля получали неинфицированную пластину, отфильтрованную только 100 мл стерильной воды.
Дезинфицирующая обработка

Концентрат Biocleanse® был получен из компании Metlab Supplies (Deeside, Великобритания). Концентрации дезинфицирующего средства, исследованные в данном исследовании, были получены путем последовательного последовательного разбавления концентрата Biocleanse®, изменяя соотношение дезинфицирующего средства и стерильной воды для получения следующих концентраций; 1.2%, 1.1%, 1%, 0.75%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.25% и 0,1% биоцид в растворе концентрата.

Разведения готовили в стерильных 15 мл культуральных пробирках с использованием калиброванной 1000 мкл автопипетки и одноразовых 10 мл пипеток. После завершения работы культуральные пробирки закрывали стерильными микробиологическими крышками и хранили при температуре 4°C (±3°C) в калиброванном холодильнике с термическим контролем, когда он не использовался.

Различные дезинфицирующие разведения (1 мл) капали на мембрану с помощью калиброванной 1000 мкл автопипетки. Один миллилитр был выбран из-за того, что это был минимальный испытанный объем, который полностью покрывал мембрану без перенасыщения пластины. Это адекватно моделировало химическую стойкость дезинфицирующего средства,которая была бы испытана организмами в неконтролируемой окружающей среде. Сушка поощрялась вращением и наклоном пластины вокруг центральной оси для обеспечения равномерного распределения дезинфицирующего средства по всей мембране, нормализуя объем дезинфицирующего средства на единицу площади. После высыхания пластин их инкубировали при 37°C (±1°C) в циклическом инкубаторе в течение 24 ч (±1 ч).
Наблюдение за колониальным ростом

По завершении инкубационного цикла пластины наблюдали за колониальным ростом. Кишечная палочка проявляла легко видимые, красные, не мукоидные колонии. P. aeruginosa продемонстрировал очень мелкие коричневые колонии, которые легко идентифицировались под ультрафиолетовым светом из-за их флуоресцентных свойств. E. faecalis оказался похожим на E. coli, разделяя ту же самую красную окраску, однако наблюдались меньшие размеры. S. aureus появился в виде непрозрачных бледно-розовых колоний. Семь повторов были выполнены и записаны в виде кое/10 мл. Для того чтобы иметь возможность проводить сравнения между реакциями различных организмов, был рассчитан процент кое, причем 100% — это кое, наблюдаемый с 0% биоцида в растворе для каждого организма.
Статистический анализ

Двусторонний дисперсионный анализ (ANOVA)использовался для определения степени различия значимости между группами окраски грамм и между отдельными организмами по всей когорте концентраций. Значимость определяли с 95% доверительным интервалом (Р < 0,05).
Результаты
Грам-положительных и Грам-отрицательных когорты

Установлено, что грамотрицательные бактерии более устойчивы к дезинфекции по сравнению с грамположительными бактериями. Инжир. На рис. 1 показано, что 0,7% биоцида в растворе является самой низкой исследуемой концентрацией, которая проявляет полное ингибирование грамположительных бактерий. Для сравнения, у грамотрицательных бактерий наблюдалось полное ингибирование при 1,1% биоцида в растворе за счет единичных колоний, наблюдаемых на меньшинстве пластинок при 1% биоцида в растворе.
Между 0% биоцида в растворе и 0,4% биоцида в растворе были установлены наиболее значимые концентрации для увеличения наблюдаемого бактериального ингибирования, так как более 90% общего бактериального ингибирования наблюдалось для грамположительных бактерий и более 60% грамотрицательных. После 0,4% биоцида в растворе уровень ингибирования постепенно замедлялся до тех пор, пока не наблюдалось полное ингибирование для обоих наборов организмов.

Были идентифицированы три основные фазы ингибирования, которые проявлялись повсеместно во всех изученных изолятах. Первая фаза, появляющаяся между 0% Биоцидом в растворе и 0,1% Биоцидом в растворе, проявлялась как постепенное нарастающее ингибирование, причем все группы организма демонстрировали чрезвычайно схожие уровни ингибирования. Вторая область, наблюдаемая от концентраций 0,1% биоцида в растворе до 0,4% биоцида в растворе, демонстрировала тенденцию, в которой все четыре организма демонстрировали фазу выраженного увеличения скорости ингибирования, причем четыре линии тренда организма, как правило, расходились друг от друга по мере постепенного увеличения концентрации. Третья и последняя область, установленная при концентрациях более 0,4% биоцида в растворе, демонстрировала чистое снижение прироста с увеличением концентрации дезинфицирующего средства, пока все организмы не достигли максимального ингибирования.Фазы торможения

Из этого исследования невозможно дать окончательное объяснение полученным результатам, но некоторые хорошо документированные характеристики, относящиеся к изученным организмам, могут иметь некоторое участие в наблюдаемых изменениях устойчивости. Поэтому нижеследующее обсуждение предлагает спекулятивный учет клеточных и молекулярных характеристик, которые могли бы внести свой вклад в такие наблюдения.

Во время фазы I можно сделать вывод, что при чрезвычайно низких суб-ингибиторных концентрациях в растворе просто недостаточно молекул BAC, чтобы вызвать значительное бактериальное ингибирование. При этих концентрациях слой ЛПС или любые другие мембранные характеристики грамотрицательных бактерий не придают организму дополнительной устойчивости, чем защитные меры, проявляемые грамположительными организмами. При более низких концентрациях деполяризация клетки еще не может быть достигнута, в результате любое ингибирующее воздействие может быть связано с бактериостатическим эффектом. Это могло бы объяснить, почему скорости ингибирования при этих концентрациях были очень похожи, независимо от организма или группы граммов.

Ожидалось, что величина ингибирования увеличивается на этапе II из-за экспоненциального характера реакции с увеличением числа молекул на единицу площади, следуя первому закону диффузии Фика (Nikaido, 2000). Многочисленные данные свидетельствуют о том, что существуют операционные пределы молекулярных функций микробной детоксикации, которые могут быть причиной значительно возрастающей скорости ингибирования между этими концентрациями. Это было продемонстрировано в работе Е. штамм coli HN1157, где насос AcrB продемонстрировал скорость истечения, которая составляла приблизительно 0,02 нмоль мг-1 с-1, что указывает на то, что порог насыщения был соблюден (Nagano and Nikaido, 2008). Как следствие этого, связывание эффлюкса станет менее эффективным, поскольку активные сайты станут менее доступными для удаления неэндогенных молекул из клетки. В этот момент требуется только минимальное добавление увеличения концентрации, чтобы вызвать катастрофическую недостаточность детоксикации и лизис.

Постепенное снижение уровня ингибирования во время фазы III указывало на то, что некоторые представители бактериальной популяции были особенно устойчивы к сопротивлению детоксикации. Бактериальное спасение внутри отвар MRD вероятно произвело население организмов на различных значениях реактивации, и таким образом резильянс к обеззараживанию. Это адекватно имитирует изменение в благополучии диких популяций бактерий.

Добавить комментарий