изотермы поглощения для АДБАХ

rx online

Изотермы поглощения.Инжир. 4 указывает на изотермы поглощения для АДБАХ и DDAC при воздействии 2 × 109 КОЕ/мл S. aureus. При применении схемы классификации поглощения, разработанной ранее Giles et al. (19), профили изотермы ADBAC и DDAC подчиняются шаблонам L4 и H3/4 соответственно.
АДБАК (рис. 4A) показали Ленгмурианское поглощение клеток с возможной тонкой точкой перегиба между 6 и 7 мкг / 2 × 109 клеток (отмечены A и B) и конечным плато (отмечено C) с максимальным поглощением около 14 мкг/2 × 109 клеток. При увеличении концентрации биоцида за пределами точки С к клеткам присоединялось мало дополнительного биоцида. DDAC (рис. 4B) обладал очень сильным начальным поглощением, представляя собой высокоаффинное связывание, и в изученном диапазоне концентраций биоцида большинство биоцидов было связано с клетками. Точка перегиба четко наблюдалась между 9 и 14 мкг / 2 × 109 клеток (отмечены A и B). За пределами точки B наблюдалось дальнейшее быстрое поглощение DDAC клетками. Точки перегиба как для ADBAC, так и для DDAC могут быть обусловлены дополнительными сайтами связывания, возникающими в результате фрагментации клеток или критического повреждения мембраны, подвергая воздействию дополнительные внутренние целевые области.

Хьюго и Лонгворт (24) ранее описали процедуру вычисления приблизительного количества молекул, необходимых для образования биоцидного монослоя на поверхности бактериальной клетки. Количество монослоев ADBAC на ячейку было рассчитано как 1,2 при завершении первичного поглощения (обозначено B на фиг. 4А). По-видимому, биоцид ADBAC может осуществлять свое действие через монослойную или супрамонослойную абсорбцию. Сорбция плато АДБАК в точке с (Рис. 4A) будет представлять собой приблизительно двухслойное поглощение. Завершение первичного поглощения DDAC происходило при связывании 14 мкг / 2 × 109 клеток (обозначено B на фиг. 4Б). Количество монослоев DDAC при завершении первичного поглощения было рассчитано равным 1,9, а плато сорбции в точке с (Рис. 4B) представляет собой приблизительно 4,4-монослойное поглощение.

Утечка внутриклеточного материала.Утечка калия для ADBAC (рис. 5A) и DDAC (фиг. 5B) при концентрациях 15 мкг/мл (0,0463 мм и 0,0460 мм соответственно) и выше достигали максимальных уровней пула в течение приблизительно 5 мин контакта при 25°C. Для DDAC доза 9 мкг/мл (0,0276 мм), по-видимому, высвобождала уровни калия до завершения в течение 45 мин, по сравнению с 9 мкг / мл (0,0278 мм) ADBAC, которая истощала внутренний пул калия только на 30%. Основываясь на изученных концентрациях, 9 мкг / мл может быть важным дифференциатором концентрации как для ADBAC, так и для DDAC; концентрации выше 9 мкг/мл (0,0278 мм и 0,0276 мм) для обоих агентов, по-видимому, быстро высвобождают весь внутренний пул калия, а Доза 4,5 мкг / мл (0,0139 мм и 0,0138 мм) индуцирует утечку, аналогичную той, что индуцируется контролем HEPES. Для ADBAC и DDAC при 35°C (данные не показаны) профили утечки были очень похожи на профили, полученные при 25°C, хотя утечка оказалась более быстрой при 35°C.
ADBAC и DDAC автоматически 260 Нм звукопоглощающего материала утечки контролируется в течение 45 мин при 25°С (рис. 6A и B); он был быстрым и достиг максимальных уровней пула при концентрациях выше 9 мкг/мл. Утечка при 9 мкг/мл была постепенной, и утечка при 4,5 мкг / мл следовала профилю утечки контроля HEPES. При повышении температуры реакции ADBAC и DDAC до 35°C (данные не показаны) наблюдалась быстрая утечка 260-Нм поглощающего материала по сравнению с таковой при 25°C, и была лишь незначительная утечка выше уровня 100% пула. Это позволило предположить, что при обеих температурах был обнаружен только в значительной степени несвязанный 260-Нм растворимый материал пула.
Средний процент утечки внутриклеточного материала в течение 30 мин как для ADBAC, так и для DDAC при 25°C (фиг. 7A и B) сравнивали с концентрацией биоцида (мкг/мл). Этот подход был использован в попытке определить приблизительные концентрации, при которых теряется первоначальная целостность мембраны и происходит последующее катастрофическое разрушение мембраны (11). Потеря целостности мембраны происходит, когда мембрана теряет соответствие и утечка превышает таковую у необработанных клеток. Катастрофическое разрушение мембраны происходит, когда полная потеря целостности мембраны происходит при воздействии биоцида, и высокие уровни внутриклеточного материала быстро высвобождаются. На рис. 7 показаны концентрации, в которых можно предположить повреждение мембран различной степени тяжести. При рассмотрении этого рисунка критическим различием между агентами ADBAC и DDAC является высвобождение материала, индуцированное в концентрации 9 мкг/мл (0,0278 мм и 0,0276 мм). Для ADBAC потеря целостности мембраны была индуцирована примерно на 9 мкг/мл (0,0278 мм), в отличие от DDAC, где диапазон лежит чуть выше 4,5 мкг / мл (0,0138 мм). Катастрофическое разрушение мембраны как для ADBAC, так и для DDAC произошло выше концентраций 15 мкг/мл (0,0463 мм) и 12 мкг/мл (0,0368 мм), соответственно. Рисунок 7 показывает, что изученные концентрации ADBAC и DDAC не вызывают значительной внутриклеточной коагуляции (39), хотя это может стать очевидным при более высоких, не исследованных концентрациях.
Влияние температуры, биоцидного агента и потери калия на автолиз.Схемы, представляющие процент утечки калия (при 45 мин) и 260-Нм материала (при 240 мин) при 25°C и 35°C как для ADBAC, так и для DDAC, представлены на фиг. 8A-D. На рис. 8A и B сосредоточены данные для ADBAC и DDAC при 25°C, соответственно. Утечка над внутренним 260-Нм материалом пула клеток (100%) (обозначена пунктирной линией на рисунках), наводящая на мысль об аутолизе, не была убедительной ни для одного из агентов. Заметная разница в утечке 260 Нм была вызвана дозой 9 мкг/мл любого агента по сравнению с 4,5 мкг/мл, и эта граница концентрации также оказывала зеркальное влияние на утечку калия.
На рис. 8C и D показано, что температура 35°C стимулирует автолитические процессы. Рисунок 8C показывает, что АДБАК индуцирует более высокие уровни аутолиза, чем ДДАК в диапазоне концентраций от 9 до 18 мкг/мл. Это также совпало с высвобождением >60% внутриклеточного калия. Действительно, концентрации между 9 и 18 мкг/мл как для ADBAC, так и для DDAC вызывали почти максимальную утечку калия по сравнению с концентрациями 4,5 мкг / мл и контролем HEPES. Это наблюдение согласуется с зависимостью между утечкой калия и началом аутолиза.

Для ADBAC и DDAC при 35°C (рис. 8C и D), были проведены статистические анализы для определения того, связана ли концентрация биоцида с зарегистрированными уровнями автолиза. Для ADBAC и DDAC был проведен односторонний дисперсионный анализ для выявления различий в количествах материала, который протекал в течение 4 ч для каждой концентрации биоцида и контрольных клеток hepes-буфера. Анализ результатов испытаний показал, что в целом разница между концентрациями биоцидов существует как для АДБАК, так и для ДДАК, что подтверждается следующими результатами: F 7,72 и значение Р 0,001 и F 6,19 и значение Р 0,002 соответственно. Дальнейший анализ графиков доверительных интервалов и парных сравнительных тестов Тьюки для ADBAC и DDAC показал, что существуют две различные группы ответа, буфер HEPES/4,5 мкг/мл и диапазон биоцидов от 9 до 18 мкг/мл, соответствующие отсутствию аутолиза или индуцированному аутолизу, соответственно, хотя в каждой группе не было существенных различий в эффективности утечки.

Аутолитических летальность.Контрольные клетки, сохраненные в буфере HEPES после воздействия биоцида, снижали жизнеспособность примерно на 30% в течение 24 ч (рис. 9А). Это говорит о том, что буфер HEPES вызывает только ограниченный стресс на клетках. Количество выживших в течение 48 ч для контрольных клеток уменьшилось примерно на 90%, поэтому сравнение данных проводилось только в течение 24 ч. После удаления биоцид, номера мобильных для ADBAC и DDAC-разоблачили ячейки уменьшается. Гилберт и Браун (17) ранее сообщили, что процедуры центрифугирования, используемые при стандартизации бактериальных суспензий, убивают значительную долю клеток в зависимости от штаммов, а также повреждают клетки, повышая их восприимчивость к бактерицидной активности.
Над 24 h, ADBAC-подвергли действию клетки в буфере HEPES были уменьшены как раз над 90%, и влияние autolysis на DDAC-pretreated клетках было 99% убивая. Следует отметить, что в течение первых 6 ч снижение числа клеток для клеток, предварительно обработанных DDAC, оказалось более быстрым, чем для клеток, обработанных ADBAC. Между 6-часовыми и 18-часовыми временными точками обе группы клеток были уменьшены почти на 90%. В 22 или 24 ч снижение числа клеток было незначительным и, возможно, не предполагало дальнейшего снижения. В точке, где не наблюдалось дальнейшей потери клеток, гибель клеток может быть отнесена к бактерицидному действию, при этом сублетально поврежденные клетки не могут восстановиться на богатой питательными веществами среде, а клетки погибают в результате аутолиза. Трудно выделить количественное (КОЕ/мл) значение для каждой из ранее названных причин гибели клеток. Оставшиеся жизнеспособные клетки смогли пережить воздействие дозы биоцида 9 мкг/мл. Для ADBAC и DDAC было отмечено, что колонии в ранние моменты времени варьировали по размеру, будучи либо большими (аналогичными контрольным клеткам HEPES), которые преобладали, либо небольшими колониями. По мере прогрессирования времени реакции наблюдались только крупные колонии.

Как показано на фиг. 9B, профиль контроля HEPES предположил, что разрушение поглощающего материала длиной 260 Нм было очевидно в течение 24 ч, и это, как сообщается, происходит в буферных средах (5). Утечка 260-Нм поглощающего материала для клеток, подвергшихся воздействию ADBAC и DDAC, превысила утечку контрольных клеток HEPES, и это было в значительной степени связано с периодом контакта биоцида 4 ч, предшествующим удалению биоцида. Скорость утечки после удаления биоцида оказалась одинаковой независимо от условий предварительной обработки.

Добавить комментарий