Экспериментальная установка Октенисепт

rx online

Экспериментальная установка
Все исследования проводились в соответствии с руководящим принципом ОЭСР 428 [13]. После мягкого размораживания кожи волосы обрезали (hair clipper: Wahl GmbH, Unterkirnach, Germany) и с помощью дерматома получали образцы кожи толщиной 500 мкм (Zimmer, Freiburg, Germany). Образцы кожи гидратировали в фосфатном буферном физиологическом растворе (PBS: 1,44 г динатриевого гидрогенфосфата, 8,0 г хлорида натрия, 0,24 г дигидрогенфосфата калия и 0,2 г хлорида калия; рН 7,4) в течение 30 минут перед использованием. Для изучения целостности кожи проводили визуальные обследования; толщину кожи определяли микрометром (Mitutoyo, Neuss, Germany 450-650 Нм).

Чтобы вызвать нарушение барьера в некоторых образцах кожи крупного рогатого скота, поверхность кожи обрабатывали ленточными полосками (Tesa, Beiersdorf, Hamburg, Germany) до 100 раз. Удаление всех слоев рогового слоя было установлено гистологическим исследованием. Эксперименты по проникновению проводились в диффузионных ячейках типа Франца (Permgear, Bethlehem, USA) со средней площадью проникновения 1,77 см2. Рецепторный отсек содержал 12 мл фосфатного буфера Soerensen (9,2 г динатриевого гидрогенфосфата, 4,2 г хлорида натрия и 2,0 г дигидрофосфата калия, рН 7,4), который непрерывно перемешивали магнитным стержнем при 500 ед/мин. Поскольку оба компонента проявляют низкую растворимость в фосфатном буфере Soerensen (< 0,1 мг / мл), в течение всего эксперимента были приняты условия поглощения. Донорский отсек заполняли 2 мл октенисепта (1,14 мл/см2) и покрывали парафильмом. Водяная баня обеспечивала постоянную температуру 32°C в каждой диффузионной ячейке. Образцы отбирали из рецепторного отсека (800 МКЛ) в каждый момент времени (1 ч, 2 ч, 3 ч, 4 ч, 5 ч, 6 ч, 22 ч, 24 ч, 26 ч, 28 ч) и заменяли 800 мкл фосфатного буфера Soerensen.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) использовалась для анализа концентрации окт и РН при следующих условиях ВЭЖХ:

автосамплер (508, Beckmann), колонка (LichroCART 125-4, 5 мкм, 18 e, 10 см, Merck), предварительная колонка (LichroCART 4-A, 5 мкм, Merck), нагреватель (SpH 99, Spark Holland; 40°C), УФ-виз-детектор (168, Beckmann).

Используемая подвижная фаза состояла из 80% метанола и 20% mcilvaine-буфера (20,8 г лимонной кислоты (безводной) и 0,4 г динатриевого гидрогенфосфата; рН 2,2) для определения окт и 20% метанола и 80% McIlvaine-буфера для определения рН. Длина волны детектирования составляла 280 Нм для окт и 270 Нм для РН соответственно. Скорость потока устанавливали на уровне 1,5 мл / мин при давлении около 0,3 МПа. 20 МПа. В ВЭЖХ вводили по 100 мкл каждого образца.

Анализ ВЭЖХ был валидирован для обоих исследуемых веществ с точки зрения селективности, линейности, точности, точности и стабильности. Селективность была доказана для каждого испытуемого вещества в хроматограмме, и линейность была дана между 600 и 10 000 нг/мл для окт и между 400 и 10 000 нг/мл для РН. точность и точность были обнаружены путем анализа стандартов контроля низкого качества (LQS), а также стандартов контроля высокого качества (HQS) на три разных дня. Относительное отклонение < 20% (точность) и < 10% (точность) были приняты для непосредственного обращения и < 15% для ВКС (аккуратность и точность). Стабильность давалась на все время эксперимента. Пределы обнаружения (LOD) составили 243,1 нг/мл для окт и 91,3 нг/мл для РН. пределы количественного определения (LOQ) составили 600 нг/мл для окт и 400 нг/мл для РН. количественный анализ проводился на основе сравнения с калибровочной кривой, а площади под кривой анализировались с использованием метода внешних стандартов. Расчет количества лекарственного средства, проникшего через кожу на 1 см2, рассчитывали по концентрации в рецепторной камере согласно Niedorf et al. (2008) [14] с использованием итерационного алгоритма для пересчета потока и переноса, основанного на фактической разнице концентраций между донорными и акцепторными отсеками за короткие промежутки времени. Таким образом, алгоритм дает нелинейную проницаемую массу на единицу площади по сравнению с кривыми времени и вычисляет как коэффициент кажущейся проницаемости (Papp), так и максимальный поток (Jmax) через 28 часов.

Количество окт и РН в роговом слое и дерме определяли после завершения диффузионного эксперимента. Поэтому образцы расщепленной кожи промывали холодной водой и кожные покровы разделяли согласно Клигману и Кристоферу (1963) [15]. Была выполнена следующая процедура экстракции: к каждому образцу перед гомогенизацией в течение 30 секунд добавляли по два мл PBS. Добавляли 20 мкл H2SO4 (2 N) и 4 мл дихлорметана и образцы встряхивали в течение 30 минут. После центрифугирования (10 минут, 4°C, 10 × g) нижнюю фазу, содержащую дихлорметан, переносили в другой флакон и выпаривали с использованием сжатого воздуха. Для растворения аналитов использовали 0,5 мл элюента. Восстановление составило примерно 90-95%.

Результаты
Окт не обнаруживалась в акцепторной среде гистологически интактной кожи ни одного исследованного вида в ходе эксперимента (Рис.1), хотя окт обнаруживалась в роговом слое и дерме всех исследованных образцов расщепленной кожи (табл. 1). Через 6 часов 2,34% и через 28 часов 2,64% примененного окт (2 мг) определяли в акцепторной жидкости барьерно нарушенной кожи крупного рогатого скота (Рис.1). РН пронизывал все образцы кожи (Рис. 2), причем наибольший поток наблюдался в коже лошади, а затем в коже бычьего вымени, от собачьей до кошачьей кожи. После нарушения барьера в коже вымени крупного рогатого скота наблюдался в 1,8 раза более высокий поток Jmax. Через 6 часов восстановление в рецепторном отсеке колебалось от 5,9% (собака) до 28,4% (лошадь), в то время как через 28 часов было обнаружено 35,1% (кошка) до 61,1% (лошадь). Все данные, полученные в диффузионных экспериментах, приведены в Табл.2 и 3. Количество рН хранения в слоях кожи указано в таблице

Добавить комментарий