Биоцид индуцированная утечка

rx online

Биоцидиндуцированная утечка и автолиз.Конечные концентрации биоцидов 4,5, 9, 12, 15 и 18 мкг/мл в дополнение к контролю гепатита исследовали против конечной суспензии S. aureus challenge 2 × 109 КОЕ / мл. Реакционные сосуды (стеклянные 100-мл широкогорлые конические колбы) содержали 45 мл биоцида плюс 5 мл бактериальных клеток. Эксперименты проводили при 25°С и 35°С на встряхивающей водяной бане (100 колебаний мин−1, с амплитудой 10 см). Перед введением клеток в биоцид проводили 10-кратное разведение исходного инокулята в буфере HEPES и 5 мл этой суспензии пропускали через фильтр 0,45 мкм (Acrodisc [32 мм] с мембраной Supor; Pall Gelman, MI) в стеклянный флакон емкостью 15 мл. Этот фильтрат представлял собой уровень утечки из S. aureus в нулевое время; эту процедуру проводили перед инокуляцией каждого реакционного сосуда.

После добавления бактериальных клеток в реакционный сосуд образцы объемом 4 мл удаляли и фильтровали в стеклянные бутылки с завинчивающейся крышкой емкостью 15 мл при 0.5, 1.5, 3, 6, 9, 15, 30, 45, 120, и 240 мин (точки времени относятся к средней точке фильтрации, которая может занять до 20 с). Каждый образец удаляли с помощью 10-мл стерильного пластикового шприца, прикрепленного к стерильной пластиковой наполнительной трубке, чтобы обеспечить легкий доступ к суспензии реакционной смеси. После каждого удаления образца шприц промывали в стерильной деионизированной воде и использовали повторно. Для каждого реакционного сосуда использовали отдельный шприц. Все фильтраты хранили при -70°С до проведения анализа.

Два дополнительных сосуда, содержащих 2 × 109 КОЕ/мл S. aureus, суспендированных в 1 мм цетримиде (предварительно разогретом до 37°C) и буфере HEPES, готовили и выдерживали в течение 1 ч при встряхивании (120 об / мин) при 37°C (Innova incubator 4230 and platform shaker 2000; New Brunswick Scientific, Edison, NJ). Эти реакционные сосуды были установлены для определения максимального внутриклеточного пула калия и для контроля утечки из клеток в отсутствие биоцида, соответственно.

Определение внутриклеточного пула 260-Нм-поглощающих material.To для определения растворимого 260-Нм поглощающего пула использовали обработку клеток трихлоруксусной кислотой в соответствии с протоколом, описанным ранее Гейлом и Фолксом (15). Спектрофотометр UV / VIS (lambda 2; Perkin-Elmer, CT) был заглушен 5% (wt/vol) образцом трихлоруксусной кислоты (подвергли действию к таким же условиям как образцы испытания). В следующих экспериментах материал, который просочился после обработки Биоцидом, регистрировали в процентах от внутриклеточного пула.

Анализ калия.Концентрацию ионов калия в образцах фильтрата определяли с помощью атомно-абсорбционного прибора Perkin-Elmer 1100B в режиме излучения пламени (длина волны 766,5 Нм; высота щели 0,7 Нм; воздушно-ацетиленовое Пламя) (21). Перед калибровкой и измерением образцов прибор подвергали аутозерою с буфером HEPES, и это периодически повторялось на протяжении всего анализа. Прибор калибровался с использованием стандартов калия (аналитический класс; Sigma-Aldrich, Poole, United Kingdom) 100, 200, 300, 400, 500, и 600 мкг / л (конечная концентрация), приготовленный в буфере HEPES. Существует линейная зависимость между выбросами и концентрацией калия.

Образцы фильтрата были разбавлены в буфере HEPES, чтобы дать уровни калия, которые могут быть обнаружены в середине калибровочного графика. Нормы калия периодически переоцениваются в ходе эксперимента для проверки точности прибора. Фильтрация и наличие буфера ADBAC, DDAC и HEPES не препятствовали анализу калия.

Анализ 260-Нм-поглощающего материала.Для каждого образца фильтрата поглощающий материал длиной волны 260 Нм определяли с помощью спектрофотометра Perkin-Elmer lambda 2 UV/VIS при длине волны 260 Нм (42). Для измерения каждой пробы фильтрата против буфера HEPES использовали подобранную пару УФ-кювет из кремнезема (hellma precision synthetic far-UV quartz, 200-2500 Нм; световой путь, 10 мм). После каждого измерения кювету промывали в буфере HEPES.

Уровни выживания и утечка 260 Нм от клеток демонстрируя аутолиз.Были приготовлены три отдельных реакционных сосуда, содержащих 18 мл объема буфера ADBAC, DDAC и HEPES. Конечная реакционная концентрация каждого биоцида составляла 9 мкг/мл, и как реакционный сосуд, так и суспензию сырья (2 × 1010 КОЕ/мл) поддерживали при 35°C. В каждый реакционный сосуд добавляли по два миллилитра суспензии сырья для получения конечной концентрации 2 × 109 КОЕ / мл. Реакционные сосуды затем выдерживали при 35°С в течение 4 ч (Миклушевская водяная баня при 100 осцилляциях мин−1, с амплитудой 10 см) для инициирования автолиза. Через 4 ч в каждый реакционный сосуд добавляли 20 мл нейтрализатора двойной прочности (hepes буфер, состоящий из 0,14% [мас./об.] лецитина и 1,0% [мас./об.] Твина 80) в течение 10 мин. Содержимое реакционного сосуда затем центрифугировали при 1,508 × g в течение 20 мин (Sorvell RT6000B; DuPont, Stevenage, Hertfordshire, England) при комнатной температуре. Затем гранулу ресуспендировали в 40 мл hepes буфера, центрифугировали и, наконец, ресуспендировали в 20 мл hepes буфера. Собранные клетки затем выдерживали при 35°C в течение всего эксперимента. Образцы объемом 3 мл удаляли при 0, 2, 4, 18, 22, и 24 ч и фильтровали (Acrodisc [32-мм, 0,45 мкм] фильтр с мембраной Supor; Pall Gelman, MI), и измеряли поглощение при 260 Нм.

Для оценки уровня выживших применялась описанная выше процедура, за исключением того, что при 0, 2, 4, 6, 18, 22, 24, через 48 ч из каждого реакционного сосуда извлекали 1 мл образца и последовательно разбавляли в буфере HEPES, а 100 мкл наносили на TSA и инкубировали при 37°C. Через 18 ч инкубации регистрировали количество колоний и переводили в КОЕ/мл выживших.

РЕЗУЛЬТАТЫ
МИКРОФОН.МИК оставался стабильным после 48 ч инкубации, и для оценки тенденций регистрировали концентрацию МИК в сравнении с инокулятом (табл.1). Рост, регистрируемый в пределах трехкратных пятен инокуляции, был последовательным при определенных условиях.

Просмотр всплывающего окна inlineView
Таблица 1.
Поведение МИК для ADBAC и DDAC против увеличения концентрации S. aureus после 48 ч инкубации с использованием среды TSA

Как показано в Таблице 1, Мик для АДБАК и ДДАК оказались неизменными в диапазоне от 1 × 105 до 1 × 107 КОЕ / мл. При увеличении инокулята до 1 × 108 КОЕ/мл МИК повышался на 0,2-0,3 мкг / мл. Резкое повышение почти в два раза MIC (1 × 108 КОЕ/мл) произошло для ADBAC, когда инокулят был увеличен до 1 × 109 КОЕ/мл, и более чем в два раза MIC был засвидетельствован для DDAC.

Бактерицидная активность.Концентрации 35, 45 и 55 мкг/мл, при вызове с 2 × 109 КОЕ / мл S. aureus, обеспечили профили уничтожения для каждого биоцида при 25°C и 35°C. общий обзор показан на фиг. 3A и B указывает, что DDAC был менее чувствителен к температуре, чем ADBAC. Профили ADBAC и DDAC предполагали первоначальное быстрое взаимодействие биоцида с клетками, вызывающее убийство, которое в конечном итоге замедлилось.
После 5 минут времени контакта концентрации ADBAC, по-видимому, имели совершенно разные конечные точки, на которые также влияла температура. Для сравнения, четвертичные аммониевые соединения диалкил (DDAC) предлагает быстрое убийство в короткое время контакта в обоих 25°C и 35°C (рис. 3Б).

Тест с двумя образцами t, предполагающий равный дисперсионный анализ при 25°C [T STAT = 8.58; P (T⇐t) two tail = 0.00035] и 35°C [t STAT = 2.51; P (T⇐t) two tail = 0.046], предположил, что при обеих температурах произошла значительная разница в убийстве между ADBAC и DDAC, причем DDAC является более мощным агентом.

Показатели концентрации и значения Q10.Значения показателя концентрации, полученные из конечной точки восстановления 2-log10 (99%) (23), составляли 1,6 и 1,8 для ADBAC и 1,6 и 1,2 для DDAC при 25 и 35°C соответственно (для значений при 25°C для ADBAC и DDAC значения r2 составляли 0,05). Хьюго и денье (23) ранее предположили, что показатель концентрации должен быть в значительной степени независим от уровня убийства. Показатели концентрации как для ADBAC, так и для DDAC были одинаковыми при 25°C. При 35°C показатель концентрации для DDAC уменьшался, а для ADBAC увеличивался.

Значения Q10 (Таблица 2) свидетельствуют о том, что при повышении температуры с 25°С до 35°С уровень наносимого поражения может быть почти в четыре раза выше. Оказалось, что на Q10 влияет концентрация биоцида при 25°C и 35°C. значение Q10 для DDAC подтверждает, что он был менее чувствителен к изменениям температуры, чем ADBAC.

Добавить комментарий