Алкилдиметилбензиламмоний хлорид купить

rx online

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Подготовке среде.N-Алкилдиметилбензиламмоний хлорид купить в med-shop24.ru , (состоящий из смеси гомологов C14 [50%], C12 [40%] и C16 [10%]) и дидецилдиметиламмоний хлорид были получены от компании Stepan, IL. Гексадецилтриметиламмоний бромид (Цетримид) был получен из Сигма, пул, Дорсет, Англия. Биоциды готовили в стерильном 0,05 м буфере HEPES (отрегулированном до рН 7,4), чтобы получить конечную концентрацию запаса 200 ppm. Биоцидные препараты выдерживали в темном, прохладном шкафу для хранения и готовили ежедневно. Все стекла предварительно обрабатывают Decon90 (СРЧК, пул, Дорсет, Англия), используя следующую процедуру: погружение в 5% (объем/объем) Decon90 в течение 24 ч, стирка в деионизированной воде, и погружение в течение еще 24 ч в 0,1 м HCl с последующим промыть в деионизированной воде.

Организм занят.Золотистый стафилококк (ATCC 6538) получали в виде лиофилизированной ампулы, а клетки регидратировали в питательном бульоне (ICN Biomedicals, Aurora, OH). Исходные клетки S. aureus кондиционировали для замораживания (55) и поддерживали при -70°C (модель № 1). MDF-U71V; Sanyo Electric Company).

Поддержание и рост культуры.Замороженные бактериальные образцы ежемесячно восстанавливали в 100 мл стерильного питательного бульона и инкубировали при 37°C в течение 18 ч. из суспензии выделяли триптоновый соевый агар (TSA) (Oxoid, Basingstoke, Hampshire, England), инкубировали при 37°C в течение 24 ч и хранили при 4°C. чистоту культуры проверяли микроскопическим исследованием и определением стафилококка (bioMerieux, Marcy l’Etoile, France). Единичные колонии, удаленные из изолирующих пластин, использовали для инокуляции 10 мл питательного бульона, который инкубировали при 37°С в течение 18 ч. После дальнейшего субкультивирования суспензию использовали для инокуляции агаровой пластины AOAC (Becton Dickinson, Sparks, MD) (дополненной гранулами агара 1,2% [wt/vol] [Oxoid technical agar no. 3]), которую выдерживали при 37°C в течение 18 ч.

После инкубации на поверхность пластины AOAC добавляли 20 мл стерильного буфера HEPES и осторожно соскребали слой бактериальных клеток. Затем клеточную суспензию дополнительно разбавляли буфером HEPES и трижды промывали центрифугированием при 1,508 × g в течение 20 мин (Sorvall RT6000B; DuPont, Stevenage, Hertfordshire, England), после чего ресуспендировали в 30 мл буфера HEPES. Исходные суспензии S. aureus при 2,0 × 1010 КОЕ/мл готовили по эталонному калибровочному графику.

Оценка микроэлементов методом разведения агара.Конечные концентрации биоцидов в диапазоне от 0 до 3,2 мкг/мл (увеличивающиеся с шагом 0,1 мкг/мл) в буфере HEPES добавляли в отдельные стерильные чашки Петри, к которым добавляли 19 мл расплавленного TSA (Oxoid, Basingstoke, Hampshire, England) при 50°C, перемешивали и давали установить.

Поверхность каждой агаровой пластины инокулировали в трех экземплярах 5 мкл инокулята challenge, содержащего 10-кратные разведения от 1 × 109 до 1 × 105 КОЕ/мл в буфере HEPES. Пластины инкубировали при 35°C в течение 48 ч. Через 24 и 48 ч визуально исследовали наличие роста на каждой пластине и регистрировали МИК. МИК определяли как концентрацию, в которой не было обнаружено роста или <10 колоний для каждого пятна инокуляции в трех экземплярах. Те клетки, которые росли в месте прививки, где регистрировался МИК, подвергались субкультуре и повторному тестированию на определение МИК. Они больше не оказывали сопротивления.

Бактерицидное тестирование.Конечные исследованные концентрации биоцидов составляли 35, 45 и 55 мкг / мл, и они были приготовлены в буфере HEPES. Реакционные сосуды (100 мл широкогорлые конические колбы) содержали 36 мл биоцида, и добавляли 4 мл суспензии бактериального сырья (2 × 1010 КОЕ/мл). Эксперименты проводили при 25°С и 35°С (встряхивание водяной баней при 100 колебаниях мин-1 и амплитуде 10 см). После воздействия на клетки биоцида 1-мл образцы удаляли и переносили в 9 мл бульона нейтрализатора aoac letheen (Becton Dickinson, Cockeysville, MD) каждые 30 С в течение до 5 мин включительно. В конце эксперимента проводили 10-кратное разбавление исходной суспензии в буфере HEPES с последующим 10-кратным разбавлением в нейтрализаторе для подтверждения исходного количества жизнеспособных клеток. Биоэкран (Labsystems, Хельсинки, Финляндия) был использован для оценки жизнеспособности всех образцов путем регистрации времени, затраченного на рост неизвестного инокулята до пороговой оптической плотности, с последующим преобразованием этого значения в определенный размер инокулята по калибровочной кривой. Стерильную 100-луночную пластину, состоящую из 10 колонок, каждая из которых содержала 10 лунок, заполненных 360 мкл питательного бульона, в которые инокулировали образцы, использовали согласно методу, описанному ранее Lambert et al. (27).

Измерение изотермы поглощения.Спектрофотометрическое определение поверхностно-активных веществ четвертичного аммония с красителем orange II (44) было модифицировано для наблюдения Изотерм поглощения для ADBAC и DDAC. Конечные концентрации 4.5, 9, 12, 15, 25, и 35 мкг / мл ADBAC и DDAC были приготовлены в 9 мл буфера HEPES. Кроме того, испытанию подвергался 9-мл объем, содержащий только буфер HEPES. К каждому 9-мл препарату добавляли по одному миллилитру суспензии S. aureus, получая конечную концентрацию 2 × 109 КОЕ/мл. Смесь перемешать каждые 20 мин в течение всего времени контакта 1 сек. После периода контакта суспензию центрифугировали (используя стеклянные центрифужные трубки) при 1,430 × g (Sorvall RC-5B; Dupont, Stevenage, England) в течение 15 мин. Затем четыре миллилитра надосадочной жидкости удаляли и смешивали с 1 мл оранжевого II красителя (4 × 10-4 м, приготовленного в 0,1 м NaCl), с последующим добавлением 5 мл хлороформа. Смесь перемешивали в течение 30 С, чтобы убедиться, что хлороформ и краситель были надлежащим образом перемешаны. Три миллилитра из нижнего слоя, содержащего краситель-биоцидный комплекс (оранжевый цвет), удаляли в УФ-кювету из кремнезема (hellma precision synthetic far-UV quartz, 200-2500 Нм; световой путь, 10 мм) и измеряли поглощение при 485 Нм. Для очистки спектрофотометра использовали буферный контроль HEPES, выделенный аналогичным способом (lambda 2; Perkin-Elmer, CT). Такие переменные, как концентрация orange II, максимумы поглощения для солей красителя, экстрагируемость соли красителя с использованием хлороформа и РН, были подтверждены методами, описанными ранее Скоттом (44). Анализ не был затронут изменениями в ПЭ-аш, буфере, и присутсвии екссудатов клетки.

Поглощение биоцида рассчитывали с использованием калибровочных графиков зависимости концентрации биоцида от поглощения при 485 Нм. Были построены профили изотермы, сравнивающие равновесную концентрацию (мкг/мл) с концентрацией поглощения (мкг/2 × 109 клеток).

Добавить комментарий